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Swift-准确、低成本的靶向甲基化测序(30024/30096)

发布时间:2021-04-30      点击次数:783

甲基化测序是研究生命个体如细胞分化和疾病进展等基因调控的重要工具,已越来越多应用到包括肿瘤诊断在内的研究中。

全基因组甲基化测序 (WGBS)的无偏好性及单碱基分辨率是理想的检测目标区域方法,也是全基因组范围甲基化状态测量的金标准。如有感兴趣的目标基因组区域,通过杂交捕获后再进行测序,这种有针对性的甲基化测序方案成本更低。特别在评估具有低频甲基化特征的复杂样本时(如液体活检中的游离DNA),可加大分析样品数量及测序深度。

通过使用Swift Accel-NGS Methyl-Seq(30024/30096/300384试剂盒与第三方定制化探针池组合方案,提供了高精度的靶向甲基化测序工作流程。该流程通过专有的文库制备和杂交化学反应及第三方独特的探针设计算法,克服了许多固有的挑战,可以有效检索特定的重亚硫酸盐转化的DNA序列。定制探针池为针对50多个癌症相关基因的启动子区域进行设计,证明该工作流程允许以极低起始量制备高度分子复杂度的甲基化测序文库,从而得到高特异、无偏好的甲基化图谱。

一、检测方案介绍

1、Library Prep: 

Accel-NGS Methyl-Seq Library Kit基于Adaptase®技术,是一种高效的、不依赖于模板的单链DNA接头连接化学方法。经过亚硫酸氢盐转化的单链DNA也可构建高度复杂文库,全面的基因组覆盖,并可支持包括低起始量(<10 ng)液体活检/cfDNA在内的多种样品类型。

2、Target Capture:

传统的杂交捕获技术可允许有限的探针-靶点不匹配,仍能有效地富集靶点区域。然而,在捕获未知甲基化状态的胞嘧啶脱胺模板时,实验设计面临如下特殊挑战:

  • 对于特定的目标区域,需要更多的探针序列来应对胞嘧啶中存在的不同甲基化状态;
  • 许多胞嘧啶经转化后,由于GC含量改变,探针-靶点杂交结合能力明显降低;
  • 胞嘧啶脱氨反应后,基因组序列的复杂性也显著降低,从而影响探针结合靶点的特异性。

由于上述问题的出现,使得甲基化捕获panel设计及成本略高于传统探针捕获设计。比如需使用甲基化特异性的探针设计算法,模拟经转化基因组模板中的两条双链上的胞嘧啶甲基化构型。此外,还需探针严格的筛选出两条双链都为完全CpG甲基化的基因组序列特异性, 以实现高中靶率和最少的位点丢失。

二、测试方法

为了证明Swift Accel-NGS Methyl-Seq(30024/30096/300384试剂盒与第三方定制化探针池组合方案可成功检测多个位点的甲基化状态,选择了50个癌症相关基因的假定启动子区域(靶区总大小约为100 kb)作为初始靶区,目标区域合成总计 20,003条探针。

为了确定该方案是否可兼容不同DNA起始量和甲基化状态,第一组文库使用了从NA12878细胞系(科里尔研究所提供)提取,经亚硫酸氢盐转化的多种起始量样品(1 ng, 5 ng, 100 ng)。使用Swift试剂盒允许很容易的获得该细胞系完整WGBS数据,从而用于后续评估靶区富集的检测准确性。第二组文库起始上样量为50 ng,使用经重亚硫酸盐转化的完全甲基化和非甲基化 DNA (Zymo Cat No. D5014-2和D5014-1)的不同组合,模拟约10%、30%、50%、70%和90%甲基化水平(以下简称“模拟文库”)。构建完成的文库使用NovaSeq S4 PE150进行测序,并测量甲基化水平及评估实验可重复性。

数据分析:原始数据使用 Trimmomatic[1] 除去接头序列及低质量碱基,cutadapt[2] 去除 Read 2 的 5 ' 端除 15 nt 序列,目的是去除大部分 Adaptase 反应所产生尾部序列。处理后的 reads 使用默认参数bismark[3] 比对至人类基因组(hg19)。使用 deduplicate_bismark 去除 PCR 重复位点,bismark_methylation_extractor 计算甲基化检测结果和 CpG 覆盖率。利用 methylKit[5] 将检测结果导入 R ,覆盖度过滤参数设置为 5。Pearson 计算  WGBS 和 methylKit 中富集文库重复实验之间的相关系数。

三、验证结果

1、低测序量也可获得目标区域高覆盖度

杂交捕获性能指标评估,包括:比对率、序列中靶率(特异性)等指标。如下图A所示,不同起始量样本1 ng,5ng,100ng,其平均序列中靶率分别为76.7% ,84.0%,84.6%。与对应WGBS数据中所测得的0.009%的中靶率相比,相当于富集约8400- 9300倍。随着DNA起始量减少,比对率和中靶率都没有显著降低,表明该方案具有不依赖于起始量的高特异性。

下图B显示,5 ng 和100 ng起始量的文库中,目标区域的平均覆盖度分别为18 x 和201 x,目标CpG位点上平均覆盖度为79 x和10 x。57%(5ng)及90% (100ng)靶区的CpG位点测序深度大于等于5(图C),这表明,在一次MiSeq运行中,相似大小捕获区域设计允许至少24个质量相似的样本共同测序。

 

2、特异性位点其甲基化定量具有高准确性

使用来自同一NA12878细胞系及Swift Methyl-Seq试剂盒进行文库构建,比较捕获和WGBS方法在目标区域甲基化水平分布结果。结果证明,WGBS和捕获文库在不同起始量时,他们之间特异性位点甲基化定量结果相关性很高。在技术重复实验中,也观察到极高的结果相关性(5 ng时r > = 0.95, 100 ng时r > = 0.99,下图A)。下图B显示以上高度相关结果也表现在区域甲基化位点检测结果高度对应。

3、所有甲基化水平高灵敏度和高准确性的检出

许多生物样本包含细胞或游离DNA的混合物,其基因组在不同位置具有不同的甲基化状态。因此,对于使用捕获流程的甲基化测序方案来说,能准确地反馈不同甲基化水平至关重要。通过“模拟文库”目标区域甲基化水平,证明检测结果可准确反应预期甲基化水平(10 - 90%甲基化)(下图A)。所有富集文库在整个目标区域位点的甲基化水平检测结果也非常一致(下图B),表明,混合模拟样品的每个位点其甲基化或非甲基化检测无偏好性。

 

四、总结

Swift Accel-NGS Methyl-Seq搭配第三方定制化甲基化panel,提供了精确和高性价比的靶向甲基化测序解决方案。方案设计含50个与癌症相关的基因启动子的目标区域,检测结果证明该检测方案允许研究者测量目标区域DNA甲基化水平,即使样本为低起始量、含有不同甲基化水平混合状态也可有着极高的特异性和灵敏度。无论核酸的质量或起始量如何,搭配Swift Accel-NGS Methyl-Seq试剂盒的靶向捕获方案成是表观遗传学相关应用研究的有力工具,在癌症相关的预测和生物标志物的发现等方面都具有巨大潜力。

文献索引:

1. Bolger, A.M., Lohse, M. and Usadel, B. (2014) Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120.

2. Martin, M. (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. Journal, 17(1), pp.10-12.

3. Krueger, F. and Andrews, S.R. (2011) Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics, 27(11), pp.1571-1572.

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