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杂交捕获的五大流程分别是怎样的

发布时间:2022-04-24      点击次数:90
   杂交捕获的原理是人工设计探针,探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合,探针会将目标区段捕获,未设计探针的区段会被洗脱丢弃,之后通过变性(一般是调节PH值到碱性)将探针和捕获区段分开,被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。
  杂交捕获的优缺点分别是怎样的:
  优点:捕获区段大,可以达到几百MB,远超PCR方案和MIP方案,同时根据探针的原理其均一性很好,均一性是评价捕获技术很关键的参数,均一性好后续测序成本就会下降。
  缺点:容易捕获非目标片段,造成成本增加。因为杂交前样本会被随机打断一般认为500bp是比较合适的长度,探针捕获时可能和目标片段部分杂交,导致一些含有部分目标区段的片段被捕获。所以捕获的特异性较差,容易捕获非目标区段。
  杂交捕获的流程如下:
  1、文库制备
  将提取后的基因组DNA利用超声或酶切的方法将基因组DNA进行片段化,并进行末端修复和接头连接,接着进行PCR及纯化。
  2、杂交反应
  将带有生物素标记的RNA/DNA探针,对DNA文库的目标区域片段进行结合(探针应过量)。
  3、链霉亲和素磁珠结合
  使用链霉亲和素磁珠结合带有生物素标记的RNA/DNA探针与DNA文库相结合的双链复合物。
  4、清洗
  利用不同盐浓度的缓冲液进行多次清洗,主要目的为去除未被探针捕获的非特异性杂交,保留目标区域的DNA从而达到捕获效率的提升。
  5、捕获后扩增
  对捕获及清洗后的DNA产物进行PCR扩增,构建完成靶向富集的测序文库。
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