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蛋白质表达、分离、纯化步骤

发布时间:2022-12-09      点击次数:195
  蛋白质表达、分离、纯化可以:
 
  (1)探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理;
 
  (2)供作结构与功能的研究;
 
  (3)作为催化剂、营养剂等。
 
  实验步骤:
 
  一:材料准备
 
  1. 实验材料:大肠杆菌 BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
 
  2. 实验仪器:摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
 
  二:实验操作
 
  1. 试剂准备
 
  2. 获得目的基因
 
  ① PCR 方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR 循环获得所需基因片段。
 
  ② 通过 RT-PCR 方法:用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA,以 mRNA 为模板,逆转录形成 cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。
 
  3. 构建重组表达载体
 
  ① 载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。
 
  ② PCR 产物双酶切后回收,在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
 
  4. 获得含重组表达质粒的表达菌种
 
  ① 将连接产物转化大肠杆菌 DH5α,根据重组载体的标志(抗 Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
 
  ② 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确, 进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
 
  ③ 以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
 
  5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
 
  ① 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中(含 100 ug/mL 氨苄青霉素),37 ℃ 震荡培养过夜。
 
  ② 按 1∶50 或 1:100 的比例稀释过夜菌,一般转接 1 mL 过夜培养物于 100 mL(含 100 ug/mL 氨苄青霉素)LB 液体培养基中,37℃ 震荡培养至 OD600 = 0.6 - 0.8(最好 0.6,大约需 3 h)。取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。
 
  ③ 对照组不加诱导剂,实验组加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l,37℃ 继续培养 1-3 h。
 
  ④ 12 000 rpm 离心 10 min,弃上清,菌体沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
 
  6. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
 
  ① NTA 层析柱的准备:在层析柱中加入 1 mL NTA 介质,并分别用 8 mL 去离子水,8 mL 上样缓冲液洗涤。
 
  ② 重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入 5 mL 上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品 60 min,4℃ 12000 rpm 离心 30 min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取 10 ul 上清样品用于 SDS-PAGE 分析。
 
  ③ 上清样品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱,收集流出液,取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。
 
  ④ 洗脱杂蛋白:用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱,直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脱液,约 3-4 h,取 10 ul 洗脱开始时的样品用于 SDS-PAGE 分析。
 
  ⑤ 洗脱目标蛋白:用 Elution Buffer 洗柱,收集每 1 mL 级分,分别取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。
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