一、体外蛋白表达试剂盒实验前准备
试剂解冻与储存
CFPE Master Mix:从-80℃取出后置于冰上缓慢解冻,避免反复冻融(解冻后3小时内完成实验)。
阳性对照模板(T7P-GFP或LET):储存于-20℃以下,解冻后同样需冰上操作。
关键提示:使用无核酸酶(Nuclease-Free)的耗材和试剂,防止DNA/RNA降解。
模板准备
质粒模板:需高纯度(如PCR纯化试剂盒处理),洗脱液使用无核酸酶水,避免盐离子干扰反应。
线性模板:通过无缝克隆技术制备后纯化,浓度调整至10-100 ng/μL,确保蛋白质产量。
故障排查:若模板含核酸酶或抑制剂(如Cl⁻、SDS),会导致表达失败,需重新纯化模板。
二、反应体系配置
反应体系设计
总反应体积:建议10 μL(可按比例放大)。
组分添加顺序:
9 μL CFPE Master Mix(EC或ECL);
1 μL阳性对照模板(或目标DNA模板,终浓度10 ng/μL);
阴性对照:9 μL Master Mix + 1 μL无核酸酶水。
关键提示:DNA模板对浓度敏感,需充分混匀,避免移液误差。
孵育条件优化
温度:29℃(水浴锅或培养箱预热至目标温度)。
时间:16小时(过夜孵育可提高产量)。
故障排查:若孵育后无表达,检查温度是否稳定(避免冷凝水进入反应管)。
三、蛋白表达与检测
表达验证
SDS-PAGE电泳:取1-2 μL反应液与5×Loading Buffer混合,95℃煮沸5分钟,跑胶检测目标蛋白条带。
荧光检测:若表达GFP等荧光蛋白,可直接用紫外灯观察荧光信号。
故障排查:若无条带,检查模板是否正确、反应体系是否污染(如核酸酶残留)。
包涵体处理
问题:原核表达中常见蛋白不正确折叠形成包涵体。
解决方案:
降低诱导温度(如16℃)和诱导剂浓度(如0.1 mM IPTG);
引入分子伴侣共表达;
包涵体纯化后复性(常用尿素或盐酸胍变性,再通过稀释/透析复性)。
关键提示:复性需遵循“低温、低浓度、小梯度”原则,可添加PEG8000或精氨酸提高成功率。
四、蛋白纯化
粗分离与层析纯化
细胞裂解:超声破碎(功率30%,超声3轮,每轮2次,冰上操作)或高压匀浆。
离心过滤:12000 rpm离心30分钟,获取上清液。
亲和层析:
His标签蛋白:用Ni-NTA琼脂糖珠或磁珠纯化,洗涤缓冲液含20 mM咪唑,洗脱缓冲液含250 mM咪唑。
GST标签蛋白:用GST琼脂糖珠纯化,洗涤缓冲液含0.1% Triton,洗脱缓冲液含10 mM还原型谷胱甘肽。
故障排查:若纯化后杂蛋白多,可联用离子交换层析(如阴/阳离子交换柱)或分子筛(凝胶过滤)。
浓缩与缓冲液置换
超滤浓缩:使用30K超滤管,4℃离心浓缩蛋白至目标体积。
脱盐柱置换:将蛋白缓冲液置换为PBS或其他适宜缓冲液。
关键提示:超滤时避免蛋白沉淀(可添加甘油或DTT稳定蛋白)。
五、纯度验证与储存
纯度检测
SDS-PAGE:考马斯亮蓝染色,目标蛋白纯度应>90%。
Western Blot:用特异性抗体检测目标蛋白,减少非特异性背景。
HPLC:高效液相色谱进一步验证纯度。
故障排查:若纯度不足,检查纯化标签是否暴露全(如His标签被遮挡需优化表达条件)。
蛋白储存
短期储存:4℃保存(含50%甘油),避免反复冻融。
长期储存:-80℃分装保存,添加蛋白酶抑制剂(如PMSF)防止降解。
关键提示:储存前需测定蛋白浓度(如BCA法),并记录纯度数据。
六、体外蛋白表达试剂盒常见问题与解决方案总结
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
蛋白不表达 | 模板质量差、反应体系污染 | 重新纯化模板,使用无核酸酶耗材,检查阳性对照是否表达 |
包涵体形成 | 表达过快、缺少翻译后修饰 | 降低诱导温度/浓度,引入分子伴侣,包涵体复性 |
纯化后杂蛋白多 | 纯化方法单一、标签暴露不足 | 联用多种层析方法(如亲和+离子交换),优化表达条件使标签充分暴露 |
蛋白降解 | 细菌蛋白酶作用、序列不稳定 | 全程低温操作,添加蛋白酶抑制剂,检查蛋白序列N端原则,换用真核表达系统 |
储存后蛋白活性下降 | 反复冻融、储存条件不当 | 分装保存,避免反复冻融,优化储存缓冲液(如添加甘油、DTT) |