Mich单链DNA定量检测试剂盒：高灵敏度荧光法原理与操作指南

　　一、技术原理
 

　　Mich单链DNA定量检测试剂盒基于荧光染料与单链DNA(ssDNA)的特异性结合实现定量检测。其核心原理如下：
 

　　荧光染料结合机制
 

　　试剂盒中的荧光染料(如SYBR Green I类似物)可嵌入单链DNA的碱基对间，形成稳定的染料-DNA复合物。当染料与单链DNA结合时，其荧光信号显著增强(通常增强100-1000倍)，而游离染料的荧光极弱。通过检测荧光强度，可间接反映单链DNA的浓度。
 

　　非特异性结合的局限性
 

　　需注意，该染料对双链DNA(dsDNA)和RNA也可能产生弱结合信号，但试剂盒通过优化染料浓度和反应体系，优先检测单链DNA。若样本中存在大量双链DNA或RNA，需通过预处理(如加热变性)将其转化为单链形式，或选择特异性更高的探针法试剂盒。
 

　　标准曲线法定量
 

　　通过已知浓度的单链DNA标准品(如1-200 ng范围)建立标准曲线，将待测样本的荧光信号与标准曲线对比，计算样本浓度。
 

　　二、操作指南
 

　　1. 实验准备
 

　　试剂盒组分
 

　　浓缩检测试剂(含荧光染料)
 

　　稀释缓冲液
 

　　预稀释的DNA标准品(1-200 ng范围)
 

　　专用检测管(推荐使用Mich Assay Tube，避免侧壁标注干扰荧光信号)
 

　　仪器与耗材
 

　　荧光计或荧光酶标仪(需支持485 nm激发/520 nm发射波长)
 

　　移液器(覆盖1-20 μL和100-200 μL量程)
 

　　DNase-free耗材(避免核酸酶污染)
 

　　样本要求
 

　　样本体积：1-20 μL
 

　　浓度范围：50 pg/μL - 200 ng/μL(检测范围1-200 ng)
 

　　兼容性：可耐受盐、游离核苷酸、溶剂、去污剂或蛋白等污染物，但需避免强酸强碱或高浓度变性剂(如尿素、甲酰胺)。
 

　　2. 实验步骤
 

　　试剂与样本准备
 

　　将试剂盒组分恢复至室温(25℃)。
 

　　轻轻颠倒混匀检测试剂，瞬时离心(避免涡旋振荡产生气泡)。
 

　　准备标准品：取10 μL标准品1(10 ng/μL)和标准品2(100 ng/μL)分别加入检测管，补加190 μL稀释缓冲液至终体积200 μL。
 

　　样本检测
 

　　取180-199 μL稀释缓冲液加入样本检测管，加入1-20 μL待测样本(终体积200 μL)。
 

　　轻轻涡旋振荡3-5秒，避免产生气泡。
 

　　室温避光孵育2分钟，使染料与单链DNA充分结合。
 

　　荧光信号读取
 

　　将检测管放入荧光计，选择“ssDNA High Sensitivity”检测程序。
 

　　记录荧光信号值，根据标准曲线计算样本浓度。
 

　　3. 注意事项
 

　　荧光淬灭控制
 

　　染料易受光降解，实验全程需避光操作(如使用铝箔包裹检测管)。
 

　　检测工作液配制后需在3小时内完成检测，避免荧光信号衰减。
 

　　标准品与样本处理
 

　　标准品需上下颠倒混匀后瞬时离心，避免沉淀影响浓度准确性。
 

　　样本若含高浓度盐或去污剂，建议用稀释缓冲液进行1:10预稀释。
 

　　污染防控
 

　　使用DNase-free耗材，避免核酸酶降解样本。
 

　　实验区域需分区操作(如配液区、样本处理区、检测区)，防止交叉污染。
 

　　三、技术优势
 

　　高灵敏度
 

　　可检测低至50 pg/μL的单链DNA，适用于痕量样本(如循环肿瘤DNA、病毒基因组)的定量分析。
 

　　宽检测范围
 

　　线性检测范围达1-200 ng，覆盖大多数实验需求(如NGS文库构建、qPCR模板定量)。
 

　　操作简便
 

　　无需复杂纯化步骤，直接混合样本与检测工作液即可读数，单次检测耗时<5分钟。
 

　　污染物耐受性强
 

　　对盐、蛋白、去污剂等常见污染物耐受阈值高，减少样本预处理步骤。
 

　　四、Mich单链DNA定量检测试剂盒应用场景
 

　　基因编辑与合成生物学
 

　　定量评估CRISPR-Cas9编辑后单链DNA修复模板的浓度。
 

　　液态活检
 

　　检测血浆中循环游离DNA(cfDNA)的单链片段比例，辅助肿瘤早期诊断。
 

　　NGS文库构建
 

　　优化文库投入量，确保Illumina等平台建库成功率。
 

　　病毒学研究
 

　　定量分析病毒基因组单链RNA(如HIV、HCV)逆转录后的单链DNA中间体。