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蛋白定量检测试剂核心作用与重要性

更新时间：2025-11-22 点击次数：18

　蛋白定量检测试剂的作用是快速、准确地测定溶液中蛋白质的浓度。

　　一、核心作用与重要性

　　1、标准化实验：在许多生物学实验中，如WesternBlot、ELISA、细胞转染、蛋白质纯化等，需要确保每个反应中加入等量的蛋白质。蛋白定量是保证实验结果可比性、可重复性和准确性的第一步。

　　2、评估样品质量：在蛋白质纯化过程中，通过测定不同步骤中蛋白质的浓度，可以计算回收率、纯化倍数，从而评估纯化方法的效率。

　　3、诊断与医疗应用：在临床检验中，测定血液、尿液等体液中的特定蛋白质（如白蛋白、免疫球蛋白）浓度，是诊断多种疾病（如肝肾功能异常、营养状况、免疫疾病）的重要指标。

　　二、工作原理

　　蛋白定量试剂的核心原理是利用蛋白质的特定化学性质或氨基酸残基与染料发生反应，产生可检测的信号（通常是颜色变化或荧光变化），这个信号的强度与蛋白质的浓度成正比。

　　主要的原理包括：

　　- 还原铜离子反应：蛋白质中的肽键在碱性条件下将Cu??还原为Cu?，后者与试剂中的其他物质反应生成有色络合物。

　　- 与特定氨基酸反应：与蛋白质中的精氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸或碱性氨基酸发生反应。

　　- 染料结合：某些染料与蛋白质结合后，其吸光度或荧光性质会发生改变。

　　- 紫外吸收：蛋白质中的色氨酸和酪氨酸在280nm处有特定的紫外吸收峰。
　　三、常见的蛋白定量检测方法及对应试剂

方法名称	常用试剂	原理	优点	缺点	适用场景
BCA法	BCA试剂盒	蛋白质在碱性环境下将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂反应生成紫色络合物（562nm）。	- 灵敏度高	- 不同蛋白质因氨基酸组成不同，显色有差异	常用、通用的方法之一，尤其适用于含有去垢剂的细胞裂解液样品。
			- 抗干扰能力强（对去垢剂耐受性好）	- 反应时间较长
			- 操作简便
Bradford法	考马斯亮蓝G-250染料	染料与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸结合，颜色由棕红色变为蓝色（595nm）。	- 非常快速（~5分钟）	- 对去垢剂非常敏感（如SDS、Triton）	适用于成分简单、不含干扰去垢剂的纯化蛋白样品。
			- 灵敏度高	- 不同蛋白质差异大
			- 成本较低	- 染料易附着在器皿上
Lowry法	Folin-酚试剂	第一步与BCA类似（铜离子反应），第二步与Folin-酚试剂反应，增强信号。	- 灵敏度高于BCA法	- 步骤繁琐	经典方法，现多被BCA法取代。
				- 干扰物质多
				- 现已较少使用
紫外吸收法	无特殊试剂，直接测量	利用蛋白质中Trp和Tyr在280nm的紫外吸收。	- 无损样品，可回收	- 受核酸污染干扰严重（核酸在260nm有强吸收）
			- 极其快速简便	- 需要蛋白质含有芳香族氨基酸
			- 无需制作标准曲线

　　四、标准操作流程

　　无论使用哪种试剂，基本流程都遵循以下步骤：

　　-制备标准品：用已知浓度的标准蛋白（通常是牛血清白蛋白BSA）配制一系列梯度浓度的溶液。

　　-与试剂反应：将标准品和待测样品分别与定量试剂混合，在特定温度下孵育一定时间。

　　-检测吸光度：使用酶标仪或分光光度计测量各管在特定波长下的吸光度值。

　　-绘制标准曲线：以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

　　-计算未知浓度：将待测样品的吸光度值代入标准曲线的回归方程，计算出其蛋白质浓度。