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MICH TLX DNA建库试剂盒

简要描述:MICH TLX DNA建库试剂盒是为illumina平台设计的 DNA 文库准备试剂盒,适用于起始量1 ng-200 ng 的 DNA 样本,试剂盒经过精心设计和优化,能够快速构建文库(2.5-3.5小时),有高效的文库转化率与扩增效率。

  • 产品型号:NGS 0602-96
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2023-06-02
  • 访  问  量:637

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详细介绍

供货周期现货主要用途用于DNA建库。
应用领域环保,生物产业,农业,制药

MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

MICH TLX DNA建库试剂盒   #NGS 0602-96(96 rxns)

 

MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) 是为 illumina 平台设计的 DNA 文库准备试剂盒, 适用于起始量 1 ng-200 ng 的 DNA 样本,试剂盒经过精心设计和优化,能够快速构建文库(2.5-3.5 小时),有高效的文库转化率与扩增效率,已经经过多样本验证可获得优异的文库与测序数据,可 用于石蜡包埋组织 DNA 样本建库。试剂盒包含了 DNA 片段化和末端修复加 A 尾的预混液、连接预 混液、高保真扩增预混液、短接头和含有 INDEX 的 PCR 引物(可以根据客户要求进行选配)

 

产品组分

TLX Buffer Mix

TLX Enzyme Mix

TLX ligase Enzyme

TLX ligase Buffer

TLX Adapter for ILM

PCR Master Mix


使用方法

磁珠: Cat#A63881,AMPure XP Beads 或其他等效产品。  

DNA 质 控:Cat#Q33238,life qubit4.0;Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或 其 他等效产品。  

其他材料:Nuclease-free water、低吸附 EP 管、无水乙醇、TE Buffer(10 mM TrisHCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、磁力架、PCR 管、PCR 仪等。


使用流程 

DNA 文库准备流程图.png
图1. DNA 文库准备流程图

实验步骤
片段化 / 末端修复 / 加 A 尾(Fragment/End Preparation/dA-Taling)
1. 将所需试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌 PCR 管中配制下表所示反应体系。

 

 

剂名称

体积

TLX Buffer Mix

4 μL

TLX Enzyme Mix

3.2 μL

gDNA

X

Nuclease-free water

Up to 20 μL

1. 片段化 / 末端修复 /dA 尾反应体系


3. 吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 按下表设置反应程序(热盖设置为 82℃)  ,将上述 PCR 管置于 PCR 仪中反应。

 

温度

时间

37℃

20 min

72℃

20 min

4℃

Hold

2. 片段化 / 末端修复 / dA 尾反应程序

 接头连接(Adapter Ligation)
1. 将所需试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 如下表所示配制反应体系。

剂名称

体积

dA-tailed DNA(3.1 步骤产物)

20 μL

TLX ligase Enzyme

2 μL

TLX ligase Buffer

8 μL

TLX Adapter for ILM

2 μL

Nuclease-free water

Up 40 μL

3. 接头连接反应体系(接头详细说明见注意事项 )


3、吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4、将上述 PCR 管置于 PCR 仪中 22℃,孵育 60min。
【注】:当投入 DNA 量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长。

连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)

A. 产物纯化操作步骤(必选)
1、准备工作:将 AMPure XP Beads 室温平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、吸取 48 μL AMPure XP Beads   (1 .2×,Beads:DNA=1.2:1)  至接头连接产物中,  涡旋混 匀或移液器吹打 10 次混匀,室温孵育 5 min。
3、短暂离心并置于磁力架上,待溶液澄清后(约 5 min),弃上清。
4、保持 PCR 管始终置于磁力架中,加入 200 μL 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,弃上清。
5、重复步骤 4。
6、保持 PCR 管始终置于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚出现龟裂(约 5 min)*。
7、   
1)  如产物无需进行片段分选,将 PCR 管从磁力架中取出,磁珠 ( 无需用水洗脱 ) 直接用于文库扩增步骤反应。


2)  如产物需进行双轮分选,  加入 52-102 μL Nuclease-free Water,涡旋振荡或轻轻吹打至充分混匀,室温静置 5 min。将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清 后(约 5 min)  ,小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中,切勿触碰磁珠(洗脱体积越大,洗脱效率越高,分选效果越好,详细说明见注意事项)。

* 等待磁珠干燥过程中,可配制 文库扩增步骤反应体系。


B. 双轮分选操作步骤(可选)

1、准备工作:将 AMPure XP Beads 室温平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、根据 DNA 片段长度要求,参考表 4 向纯化产物中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液 器吹打 10 次混匀。

DNA 片段大小

150 - 250 bp

200-300 bp

300-400 bp

400-600 bp

500-700 bp

DNA 文库大小

250 - 350 bp

300-400 bp

400-500 bp

500-700 bp

600-800 bp

一轮磁珠体积

0.70X

0.65X

0.62X

0.48X

0.44X

二轮磁珠体积

0.25X

0.25X

0.16X

0.16X

0.16X

4 文库双筛对应磁珠体积参照表

【注】:表中“0.7×”表示样品 DNA 体积的 0.7 倍。如文库插入片段长度为 200 bp,样品 DNA 体积为 100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为 0.70×100 μL=70 μL;第二轮分选磁珠使用体积为 0.25×100 μL=25 μL。


3、室温孵育 5min。将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约 5 min)  ,小 心转移上清到干净的 PCR 管中。
4、参考表 4 向上清中加入第二轮分选磁珠。涡旋混匀或移液器吹打 10 次混匀,室温静置 5 min。
5、 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约 5 min),弃上清。
6、保持 PCR 管始终处于磁力架中,加入 200 μL 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,弃上清。
7、重复步骤 6。
8、保持 PCR 管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚出现龟裂(约 5 min)*。
9、将 PCR 管从磁力架中取出,磁珠 ( 无需用水洗脱 ) 直接用于文库扩增实验。
* 等待磁珠干燥过程中,可配制 文库扩增步骤反应体系。


文库扩增(Library Amplification)

1、将表 5 所需试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2、如下表所示配制反应体系。

剂名称

体积

Adapter Ligated DNA(3.3 步骤产物)

干燥后的磁珠

PCR Master Mix

10 μL

I7 Primer

1 μL

I5 Primer

1 μL

Nuclease-free water

8 μL

5 库扩增反应体系 

【注】:  含有 Index PCR 引物(i5 Prmier i7 Primer)  信息详见 MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)说明。

3、将配置好的 PCR 反应液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步骤完成后的含有磁珠的 PCR 管中,  吹打或 振荡混匀,并短暂离心。

4、按下表设置反应程序,将上述 PCR 管置于 PCR 仪中反应。

温度

环数

98℃

2 min

1

98℃

30 s

照注意事项四:关于文库扩增的表 1

65℃

30 s

72℃

40 s

72℃

4 min

1

4℃

Hold

*

6 PCR 扩增反应程序


产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)

同:产物纯化操作步骤。使用 AMPure XP Beads(1×,Beads:DNA=1:1)  纯化文扩增产物,  最后加适量 Nuclease-free water(20-50 μL)  进行洗脱(产物如需保存请 使TE Buffer 洗脱)。

文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见:注意事项中的关于文库质检


注意事项
关于操作
1、请穿实验服并戴一次性手套进行实验。
2、使用前请将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3、混匀时请轻轻吹打或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4、为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的一次性枪头。
5、推荐在带热盖的 PCR 仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR 仪至反应温度附近。
6、请在洁净的实验环境下实验,避免污染。

TLX Adapter for ILM 说明
1、TLX Adapter for ILM 采用短接头模式。
2、接头浓度:15 μM; 直接用于相应建库试剂盒连接体系里即可。
3、-20℃保存,使用前提前融化,尽量低温融化,避免在超过 30℃的环境中融化。
4、建库推荐使用量:常规 DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns;其他 DNA 投入量需要适当调 整接头使用量。

关于磁珠纯化与分选
1、DNA 片段选择步骤可在接头连接后或文库扩增后进行。
2、 Input DNA 质量≥ 50 ng,  建议在接头连接后分选;  如 Input DNA 质量<50 ng  可在 文库扩增后进行分选。
3、TLX Ligase Buffer 包含高浓度的 PEG,对双轮磁珠分选产生显著影响。因此,当在接头 连接后进行片段选择,须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在文库扩增后进行片 段选择,可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4、磁珠使用前应先平衡至室温,并混匀再使用,否则会导致得率下降。
5、80% 乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
6、进行片段选择时, 初始样品体积应尽量≥ 100 μL, 初始样本体积越大, 片段选择效果越好。

关于文库扩增

1、文库扩增循环数与文库产量和文库质量有直接关系,请参照下表列举的本试剂盒设置扩增 循环数,并摸索合适的循环数。

DNA 投入量

获得 100 ng 文库需要循环数

获得 300 ng 文库需要的循环数

250 ng

1-4

5-7

100 ng

2-5

6-8

50 ng

4-7

8-10

10 ng

6-8

9-12

5 ng

7-10

11-14

1 ng

9-11

12-15

1. 文库扩增循环数参照表

【注】:如文库扩增后需要做片段选择时参照较高循环数扩增。


关于文库质检
1、通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2、文库浓度检测可使用:基于双链 DNA 荧光染料的方法, 如 Qubit® 或 qPCR 绝对定量的方法。
3、文库长度分布检测,可通过 Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛细管电泳或微控流原理的 设备进行检测。

运输与保存方法

 -20℃运输。
所有组分 -20° C 保存,有效期 1 年。


MICH TLX DNA建库试剂盒产品信息

 

品货号

名称

规格

NGS 0602-8

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

8 rxns

NGS 0602-24

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

24 rxns

NGS 0602-96

MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)

96 rxns

  

 

 

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